Large-volume multicolor multiphoton microscopy applied to mouse brain imaging
Microscopie multiphoton multicolore grand volume appliquée à l’imagerie du cerveau de souris
Résumé
The cellular architecture of the brain is largely defined during early development. The respective roles of the different biological mechanisms leading to this organization are still poorly understood, due to the great complexity of brain tissue. Experimental analysis of this complexity requires the ability to image brain tissue in three dimensions with cellular resolution, which poses considerable challenges for both microscopy (optical heterogeneity of brain tissue) and data management (several teraoctets/acquisition).This thesis work focused on the development of a high-volume color microscopy method for robustly mapping ex vivo mouse brains with micrometer resolution, whatever their stage of development (ChroMS-2). The method is based on chromatic multiphoton serial microscopy (ChroMS), optimized for imaging tissues labeled with combinations of fluorescent proteins of different colors ('Brainbow').In the first part, we present the reconstruction and optimization of the ChroMS microscope, in order to accelerate acquisition throughput, improve data quality and ensure the microscope's reliability. In particular, this work has resulted in a time saving of two orders of magnitude for volume acquisition compared with the previous prototype, enabling us to map a cubic millimeters of tissue in minutes, or an adult mouse brain in a few days.In the second part, we detail the implementation of an automated pipeline for processing and reconstructing these large images. In particular, we discuss the problems associated with the presence of deformations in the images and their processing for volume reconstruction.Finally, a third section presents the application of this new imaging system for different projects. We discuss the development of a preparation and acquisition protocol for mapping brain tissue in mice at different stages of development, and present the images obtained. We also illustrate the versatility of the ChroMS platform and its possible use on other organs (heart, spinal cord), or species (chicken) and with contrast sources other than fluorescence (harmonic generation).
L’architecture cellulaire du cerveau est en grande partie définie au cours du développement précoce. Les rôles respectifs des différents mécanismes biologiques menant à cette organisation sont encore mal compris, à cause de la grande complexité du tissu cérébral. L'analyse expérimentale de cette complexité nécessite de pouvoir imager le tissu cérébral en trois dimensions avec une résolution cellulaire, ce qui pose des défis considérables à la fois en microscopie (hétérogénéité optique du tissu cérébral) et en gestion de données (plusieurs teraoctets/acquisition).Ce travail de thèse a porté sur le développement d'une méthode de microscopie grand volume couleurs permettant de cartographier de façon robuste des cerveaux de souris ex vivo avec une résolution micrométrique, quel que soit leur stade de développement (ChroMS-2). La méthode repose sur la microscopie multiphotonique couleurs en coupes sériées, ou ChroMS (chromatic multiphoton serial microscopy), optimisée pour imager des tissus marqués avec des combinaisons de protéines fluorescentes de différentes couleurs ('Brainbow').Nous présentons d'abord le fonctionnement et l'optimisation du microscope ChroMS, de façon à accélérer le débit d’acquisition, améliorer la qualité des données, et assurer la fiabilité du microscope. Ce travail a notamment permis de réaliser un gain de temps de deux ordres de grandeur pour l'acquisition volumique par rapport au prototype, permettant ainsi de cartographier un millimètre cube de tissus en quelques minutes, ou un cerveau de souris adulte en quelques jours.Ensuite, nous détaillons la mise en place d'un pipeline automatisé de traitement et reconstruction de ces grandes images. En particulier, nous discutons les problèmes liés à la présence de déformations dans les images et leur traitement pour la reconstruction des volumes.Enfin, nous présentons l'application de ce nouveau système d'imagerie pour différents projets. Nous discutons la mise au point d'un protocole de préparation et d’acquisition permettant de cartographier le tissu cérébral de souris à différents stades de développement, et présentons les images obtenues. Nous illustrons également le caractère versatile de la plateforme ChroMS et son utilisation possible sur d'autres organes (cœur, moelle épinière), ou espèces (poulet) et avec d’autres sources de contraste que la fluorescence (génération d'harmoniques).
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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